反相色谱柱的清洗和再生方法

反相色谱柱的清洗和再生是维护色谱柱性能、延长使用寿命的重要步骤。以下是具体的清洗和再生方法：

一、清洗方法

1. 日常清洗：

   • 每次色谱柱使用完毕后，都应进行日常常规清洗。
   • 首先使用10%甲醇水清洗1个小时，以去除大极性杂质。
   • 然后使用纯甲醇清洗1个小时，以去除非极性杂质。

2. 针对特定污染物的清洗：

   • 如果色谱柱被蛋白质等生物物质污染，可以使用高比例的强极性溶剂（如乙腈∶异丙醇=1:2，V/V）进行冲洗，或者使用0.1%的三氟乙酸水溶液、0.1%乙酸水溶液、1%十二烷基硫酸钠（SDS）等溶液进行清洗。
   • 清洗过程中，可以逐步过渡到强洗脱溶剂，例如逐渐增加乙腈的含量，以确保去除强吸附物质。
   • 如果使用了梯度洗脱，可以逐步反向梯度，减少高强洗脱成分的比例，确保全程清洗干净。

3. 特殊技巧：

   • 对于硅胶基质键合反相柱，在未使用缓冲溶液的条件下，可以使用一系列溶剂进行清洗，如100%甲醇、100%乙腈、75%乙腈/25%异丙醇、100%异丙醇、100%二氯甲烷、100%正己烷等。每种溶剂冲洗至少10个柱体积，以确保清洗效果。
   • 如果怀疑柱子被严重污染，可以使用二甲亚砜（DMSO）或二甲基甲酰铵和水按50:50的比例混合，以低于0.5ml/min的流速冲洗色谱柱。

二、再生方法

1. 反冲再生：

   • 当色谱柱出现柱效下降、峰分叉、拖尾、分离度不好等情况时，可以考虑进行反冲再生。
   • 将色谱柱反接，不接检测器，先用流动相A（如900ml水+100ml乙腈+3ml磷酸）以正常使用流速的一半冲洗300分钟。
   • 再用流动相B（如900ml乙腈+100ml水+3ml磷酸）以正常使用流速的一半冲洗300分钟。
   • 最后用异丙醇以正常使用流速的一半冲洗2个小时。整个过程可以晚上进行，以节省时间。

2. 注意事项：

   • 在进行清洗和再生之前，应确保所有样品已通过色谱系统，并尽量用流动相冲洗残留样品。
   • 在切换溶剂时，应避免突然转换到高浓度有机溶剂，以防止缓冲盐沉淀导致的问题。
   • 在使用特定清洗溶剂之前，最好先咨询柱子的厂商，以确保这些溶剂不会对填料带来损坏。
   • 清洗和再生过程中，应密切注意色谱柱的压力变化，以避免因压力过大而导致的损坏。

综上所述，反相色谱柱的清洗和再生需要根据具体情况选择合适的方法和溶剂。通过合理的清洗和再生步骤，可以有效地恢复色谱柱的性能并延长其使用寿命。