HPLC色谱柱常见问题解答

HPLC液相色谱常见问题及故障排除

第一章、简要说明及一些必要的提示

当您遇到问题时,我们需要先判断问题出在什么地方,最好的方法就是排除法,在其他条件不变的情况下,改变其中一个条件,如果问题依然没有改变,则问题不是出在改变了条件的部分,然后再一个一个改变其他条件,直到找出可以影响问题结果的所有条件为止。

接下来,再看看这些对结果有影响的条件,有哪些条件是可以做适当调整的,然后再慢慢调整,直到得到满意的结果为止。

如果以上方法不能得到满意的结果,您就可能需要完全的更换某些条件,比如更换色谱柱,更换保护柱,更换接头,更换溶剂等等。

本手册将从四个方面列出一些液相色谱中常见的问题,并对可能的原因一一分析,最后给出解决方法。这四个方面如下:

• 1.压力异常

• 2.漏液

• 3.谱图问题

• 4.进样阀问题

预防措施

许多液相色谱的故障是可以通过日常维护避免的,例如:定期的更换柱塞杆密封可 以避免柱塞密封的磨损以及由此产生的相关的故障。第六章列出了很多液相色谱的常见故障以及预防措施及建议。您需要针对您的色谱仪器类型灵活调整这些建议并使之成为实验室日常维护工作的一部份。

第二章、常见问题之压力异常

操作压力的变化往往是故障的征兆,从下列原因中找出最接近的现象,并在右侧的 列表中找出相应的解决方法。

  • 没有压力显示,没有流动相流动                                  1

 

原因 解决办法
电源问题 接通电源、开机
保险丝被烧坏 更换保险丝
控制器设定不正确或设定失败 a. 采取恰当的设定b. 修理或更换控制器
柱塞杆折断 更换柱塞杆
泵头内有空气 溶剂脱气、启动泵抽出空气
流动相不足 a. 补充流动相b.   更换入口筛板
单向阀损坏 更换单向阀
漏液 拧紧或更换手紧接头

 

  • 流动相流动正常,但没有压力显示                                2

 

原因 解决方法
仪表损坏 更换仪表
压力传感器损坏 更换压力传感器

 

C、压力持续偏高                                                  3

原因 解决方法
流速设定过高 调整流速设定
柱前筛板堵塞 a. 在允许情况下反冲色谱柱b. 更换筛板*

c. 更换色谱柱

流动相使用不当或缓冲盐的结晶沉淀 a.使用恰当的流动相b.冲洗色谱柱
色谱柱选择不当 选择恰当的色谱柱
进样阀堵塞 清洗或更换进样阀
柱温过低 提高温度
控制器失常 修理或更换控制器
保护柱阻塞 清洗或更换保护柱
在线过滤器阻塞 清洗或更换在线过滤器

 

D、压力持续偏低                                                  4

原因 解决方法
流速设定过低 调整流速
系统漏液 确定漏液位置并维修
色谱柱选择不当 选择恰当的色谱柱
柱温过高 降低温度
控制器失常 维修或更换控制器

 

E、压力不断上升

原因 解决方法
见表3 见表3

 

F、压力降为零

原因 解决方法
见表1和2 见表1和2

 

G、压力不断下降,但不回零

原因 解决方法
见表4 见表4

 

H、压力波动

原因 解决方法
泵中有气体 a. 溶剂脱气b. 从泵中除去气体
单向阀损坏 更换单向阀
泵密封损坏 更换泵密封
脱气不充分 a. 溶剂脱气b. 改脱气方法(使用在线脱气法等)
系统漏液 确定漏液位置并维修
使用梯度洗脱 由于流动相粘度的变化引起的压力波动是正常的

 

第三章、常见问题之漏液

通常漏液问题可以靠拧紧或更换管路接头来解决,但值得注意的是过度拧紧会导致 金属接头的漏液和塑料接头的磨损。如果通过稍微拧紧接头不能解决漏液,就必须 将接头取下,检查是否损坏(例如:卡套损坏、密封表面有杂质);损坏的接头应该更换掉。

A、接头处漏液

原因 解决方法
接头松动 拧紧
接头磨损 更换
接头过紧 a.       拧松,再重新拧紧b.      更换接头
接头被污染 a. 拆下清洗b. 更换接头
部件不匹配 使用同一品牌的配件

 

B、泵漏液

 

原因 解决方法
单向阀松动 a. 拧紧单向阀(不必拧得过紧)b. 更换单向阀
接头松动 拧紧接头(不必拧得过紧)
混合器密封损坏 a. 更换混合器密封b. 更换混合器
泵密封损坏 维修或更换泵密封件
压力传感器损坏 维修或更换压力传感器
脉冲阻尼器损坏 更换脉冲阻尼器
比例阀损坏 a. 检查隔膜,如果漏液立即更换b. 检查手紧接头,如果损坏立即更换
放空阀损坏 a. 拧紧放空阀b. 更换放空阀

 

C、进样阀漏液

原因 解决方法
转子密封损坏 重新安装或更换进样阀
定量环阻塞 更换定量环
进样口密封松动 调整
进样针头尺寸不合适 使用恰当的进样针
废液管阻塞 更换废液管
废液管中产生虹吸 保持废液管高于废液液面

 

D、色谱柱漏液

原因 解决方法
尾端接头松动 拧紧接头
卡套内有填料 拆下、清洗卡套、重新安装
筛板厚度不合适 使用合适的筛板(参考下表)

筛板选择指南

填料粒径 筛板孔径
2-4um 0.5um
5-20um 2um

 

E、检测器漏液

原因 解决方法
流通池垫片损坏 a. 避免过大的背压b. 更换垫片
流通池窗破碎 更换窗片
手紧接头漏液 拧紧或更换
废液管阻塞 更换废液管
流通池阻塞 重新安装或更换

 

第四章、常见问题之谱图问题

液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来,其中有一些问题可以通过改变设 备参数得到解决,而其它问题必须通过修改方法来解决问题。选择正确色谱柱和流 动相是得到好的色谱图的关键。

A、峰拖尾

原因 解决方法
筛板阻塞 a. 反冲色谱柱b. 更换进样口筛板

c. 更换色谱柱

色谱柱塌陷 填充色谱柱/更换色谱柱
干扰峰 a. 使用更长的色谱柱b. 改变流动相/或更换色谱柱
流动相pH选择错误 调整pH值,对于碱性化合物的分离,低pH值可使峰形更对称
样品与填料的活性位点发生反应 a.       加入离子对试剂或挥发性碱性改性剂

b. 更改色谱柱

 

B、峰前延

原因 解决方法
柱温低 升高柱温
样品溶剂选择不恰当 使用流动相作为样品溶剂
样品过载 降低样品含量
色谱柱损坏 反冲或更换色谱柱

 

C、峰裂分

 

原因 解决方法
保护柱或分析柱进样口污染 取下保护柱再分析:若有需要,应更换保护柱

若是分析柱进样口堵塞,拆下来清洗。

如果分析柱阻塞,可以反冲色谱柱。

如果问题仍然存在,可能是色谱柱被强

保留物质污染,可运行适当的再生措

施。如果仍不能解决问题,可能是进样

口堵塞,可以更换筛板或色谱柱。

样品溶剂不溶于流动相 改变样品溶剂。如果可能,使用流动相为样品溶剂。

 

D、大峰变形

原因 解决方法
样品过载 减少进样量

 

E、较早洗脱峰变形

原因 解决方法
样品溶剂选择不恰当 a. 减少进样体积b. 用更弱的溶剂

 

F、较早洗脱出的峰拖尾程度大于较晚洗脱出的峰

原因 解决方法
柱外效应 a.        调整系统连(使用更短、内径更小的管路)

b. 使用小体积的流通池

 

G、容量因子(k’)增加时,拖尾更严重

原因 解决方法
二级保留效应,反相模式 a.       加入三乙胺(碱性样品)b.      加入乙酸(酸性样品)

c.       加入盐或缓冲剂(离子型样品)

d.      更换色谱柱

二级保留效应,正相模式 a.       加入三乙胺(碱性样品)b.      加入乙酸(酸性样品)

c.       加入水(多官能团化合物),仅适

用于使用水溶性流动相的正相方法

d. 试用另一种液相色谱方法

二级保留效应,离子对 加入三乙胺(碱性样品)

 

H、酸性或碱性化合物的峰拖尾

原因 解决方法
缓冲液不合适 a.       使用浓度50-100mM的缓冲液b.      使用与流动相pH值相等pKa的缓

冲液

 

I、额外的峰

原因 解决方法
样品中有其他化合物 正常
前一次进样未洗脱出的峰 a.       增加运行时间或梯度斜率b.      提高流速
空缺或鬼峰(购买专门的鬼峰消除小柱,解决鬼峰问题)点击这里获取鬼峰柱信息 a.       检查流动相是否纯净b.      使用流动相作为样品溶剂

c.       减少进样体积

污染 过滤样品

 

J、保留时间改变(保留时间在5%左右波动一般被视为正常)

原因 解决方法
温控不当 维持柱温不变
流动相变化 防止变化(蒸发、反应等)
色谱柱平衡不充分 在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱

 

K、保留时间突然变化

原因 解决方法
流速变化 重新设定流速
泵中有气泡 从泵中除去气泡
流动相选择不恰当 a.       更换合适的流动相b.      检查流动相混合器

 

、基线漂移

原因 解决方法
柱温波动(即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差折光检测器、电导检测器或较高灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器) 控制好柱子和流动相的温度,在检测器之前使用热交换器
流动相不均一(基线向上漂移,流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移) 使用色谱纯溶剂、高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气,使用过程中用氦气
流通池被污染或有气体 用甲醇或其他强溶剂冲洗流通池,如有需要,可以用1N的硝酸清洗 (不要用盐酸)
检测器出口阻塞(高压造成流通池窗破裂,产生基线噪音) 清理阻塞物或更换管路。参考检测器手册更换流通池窗
流动相配比不当或变动流速 调整配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速
柱平衡慢,特别是更换流动相时 用中等强度的溶剂进行冲洗,在分析前用10-20倍柱体积的新流动相对柱子进行冲洗
流动相污染、变质或由劣质溶剂配成 检查流动相的组成。使用优质化学试剂及色谱纯溶剂
样品中有强保留的物质(高k’ 值) 以馒头峰样被洗脱出,从而表现出一个逐步升高基线(梯度分析会使其加剧) 使用保护柱,如有必要,在进样之间或在分析过程中定期使用强溶剂冲洗柱子
循环使用流动相,但检测器未调整 重新设定基线。如循环流动相已超出检测器检测范围,使用新的流动相
检测器(UV)没有设定在最大吸收波长处 将波长调整至最大吸收波长处

 

M、基线噪音(规则的)

原因 解决方法
在流动相、检测器或泵中有空气 流动相脱气,冲洗系统以除去检测器或泵中的空气
漏液 见第三章。检查管路接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换泵密封
流动相混合不完全 用人工配置流动相或使用低粘度的溶剂
温度影响(柱温过高,检测器未加热) 减少差异或使用热交换器
在同一条线上有其他电子设备 断开LC、检测器和记录仪,检查干扰是否来自外部,加以更正
泵脉冲 在系统中加入脉冲阻尼器

 

N、基线噪音(不规则的)

原因 解决方法
漏液 见第三章。检查管路接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换密封。 检查检测器流通池是否漏液
流动相污染、变质或由劣质溶剂配成 检查流动相的组成
流动相溶剂不互溶 选择互溶的流动相
检测器/记录仪电子元件问题 断开检测器和记录仪的电源,检查并更正
系统内有气泡 用强溶剂冲洗系统
检测器内有气泡 冲洗检测器,在检测器后面安装背压调节器
流通池污染(即使是极少的污染物也会产生噪音) 用1N的硝酸(不能用盐酸)清洗流通池
检测器灯能不足 更换氘灯
色谱柱硅胶或填料流失 更换色谱柱
流动相混合不均匀或混合器工作不正常 维修或更换混合器,在使用等度模式时,建议离线流动相配制

 

O、宽峰

原因 解决方法
变动流动相组成 重新配制流动相
流动相流速太低 调节流速
漏液(特别是在柱子和检测器之间) 见第三章,检查管路接头是否松动,泵是否漏液、是否有盐析出和不正常的噪音。如果必要,更换密封
检测器设定不正确 调整设定
柱外效应a.       柱子过载

b.      检测器响应时间过长或流通池体积过大

c.       柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大

d.      记录仪响应时间太长

a.       减少上样量(如10μL vs. 100μL) 或1:10和1:100稀释样品b.      减少响应时间或使用更小的流通池

c.       使用内径为0.005 – 0.007英寸的较短管路

d.      减少响应时间

缓冲液浓度太低 增加浓度
保护柱污染或失效 更换保护柱
色谱柱污染或失效,塔板数较低 更换同样类型的色谱柱
柱入口塌陷 更换柱子
洗脱出的峰含有两个或多个未被完全分离的化合物 选择其它类型的色谱柱以改善分离效果
柱温过低 提高柱温。除非色谱柱制造商注明,否则温度不宜超过60°C
检测器时间常数太大 使用较小的时间常数

 

P、分离度低

原因 解决方法
流动相污染或变质(引起保留时间变化) 重新配制流动相
保护柱或分析柱阻塞 取下保护柱再分析,如需要可更换保护柱,若是分析柱堵塞,可反冲色谱柱,如果问题仍然存在,可能是柱子被强保留物污染,可运用适当的再生措施,若还不行,可能是入口处堵塞,可以更换筛板或色谱柱

 

Q、所有的峰面积都太小

原因 解决方法
检测器衰减设定过高 降低衰减设定
检测器时间常数设定太大 设定较小的时间常数
进样量过低 a.       增加样品浓度b.      如果柱规格允许,增大进样量
记录仪连接不当 正确连接记录仪

 

R、所有的峰面积都太大

原因 解决方法
检测器衰减设定过低 提高衰减设定
进样量过高 a.       降低样品浓度b.      减少进样量,使用更小的样品定量环或部分定量环进样
记录仪连接不当 正确连接记录仪

 

第五章、进样阀的问题

以下问题在使用进样阀过程中有可能产生。

进样阀漏液问题及其解决方法已经在第三章介绍过。

A、手动进样阀,转动不灵

原因 解决方法
转子密封损坏 更换或调整转子密封
转子太紧 调整转子的松紧度

 

B、手动进样阀,进样困难

原因 解决方法
进样阀安装不当 重新安装
定量环阻塞 更换定量环
进样针污染 清洗或更换进样针
管路阻塞 清洗或更换管路

 

C、自动进样阀,不能转动

原因 解决方法
无气压(或电源) 提供恰当的压力(电源)
转子太紧 调整转子的松紧度
进样阀安装不当 重新安装

 

D、自动进样阀,其它问题

原因 解决方法
阻塞 清洗或更换阻塞部件
机械故障 见随机维修手册
控制器故障 维修或更换控制器

 

第六章、常见故障及日常预防维护

下表中列出了液相色谱操作中常见的一些问题,右侧中则列出日常维护的方法以减 少问题出现的频率。 仪器自带的用户手册则提供您更多的维护方法。

A、溶剂瓶

原因 预防维护
入口过滤器阻塞 a.       更换(每3-6个月)b.      过滤流动相,0.5µm滤膜
气泡 流动相脱气

 

B、泵

原因 预防维护
气泡 流动相脱气
泵密封损坏 更换(每3个月)
单向阀损坏 过滤流动相、使用入口过滤器,准备备用单向阀

 

C、进样阀

原因 预防维护
转子密封损坏 a.       不要拧的过紧b.      过滤样品

 

D、色谱柱

原因 预防维护
筛板阻塞 a.       过滤流动相b.      过滤样品

c.       使用在线过滤器或保护柱

柱头塌陷 a.       避免使用pH>8的流动相 (针对大部分硅胶的色谱柱)

b.      使用保护柱

c.       使用预柱(饱和色谱柱)

 

E、检测器

原因 预防维护
氘灯失效,检测器响应降低,噪音扩大 更换(每6个月)或准备备用灯
流通池有气泡 a.       保持流通池清洁b.      池后使用反压抑制器

c.       流动相脱气

 

特别提示:污染物会导致下列问题

 • 背压升高

• 峰裂分

• 峰展宽

• 基线噪音

• 基线漂移

• 分离度降低

• 色谱柱的永久损坏

 • 系统损坏

建议使用HPLC保护柱来保护您的HPLC色谱柱和结果,点击这里获取保护柱信息。

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